tembusu病毒（tmuv）是一大群單正鏈，有包膜。rna病毒。這種病毒通過吸血的節(jié)肢動物(蚊子、蜱蟲、白飛等)傳播而引起感染。在中國，tembusu病毒（tmuv）爆發(fā)和傳播給我國水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失。本文由江蘇農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所趙冬敏博士發(fā)表frontiers in microbiology雜志發(fā)表題目identification of glucose-regulated protein 78 (grp78) as a receptor in bhk-21 cells for duck tembusu virus infection該研究報告了研究論文bhk-21細胞中tmuv結合分子探究。

研究背景

自2010年以來，tembusu病毒（tmuv）嚴重的鴨病在我國許多省份引起并迅速傳播。tembusu病毒屬于黃病毒，由三種結構蛋白(包膜[e]，衣殼[c]和膜[m]）它由七種非結構蛋白組成。黃色病毒e蛋白質主要作為受體結合蛋白，是毒性、細胞向性和宿主范圍的主要決定因素。黃病毒感染作為包膜病毒的第一步涉及e蛋白質與宿主細胞受體的結合。黃色病毒可以識別單個細胞的表面分子或使用多個受體進入細胞。然后，黃色病毒通過網(wǎng)格蛋白介導的吞咽進入細胞并傳遞給內(nèi)體。內(nèi)體的酸性條件觸發(fā)e蛋白質介導病毒與內(nèi)膜的膜融合。最后，形成一個融合孔，將核衣殼釋放到細胞溶膠中。近年來，鑒定了多種組合因素，表明黃病毒可以利用多種受體進入細胞，這是菌株特異性和/或細胞類型依賴性。bhk-21細胞中tmuv結合分子還不清楚。

實驗方法

1. ip lc-ms/ms病毒與受體結合鑒定

2.?western blot以及免疫熒光檢測受體的表達

3.過表達功能實驗

結果分析

1.鑒定grp78是tmuv膜蛋白結合

使用病毒覆蓋蛋白結合測定參與初步鑒定tmuv結合的bhk-21細胞中的分子。70kda獨特的病毒組合條帶。tmuv時，tmuv特異性結合帶不能單抗檢測(圖)1a）。通過質譜鑒定，在70kda九種蛋白質是在條帶中確定的。八種蛋白質參與細胞代謝和骨架。grp78已被認定為日本腦炎病毒denv作者決定對受體進行研究grp78是否在tmuv與細胞結合起作用。如圖1所示，抗性grp78抗體可以特異性識別70kda蛋白質條帶進一步證實tmuv和grp78相互作用。

圖1 |鑒定grp78是tmuv膜蛋白結合

2.grp78抗體競爭性抑制tmuv進入

bhk-21細胞與針對grp78的n-或c-抗體在末端結構區(qū)預孵化，然后進行tmuv感染。在n-末端grp78病毒rna水平顯著低于非特異性兔igg細胞的處理，表明n末端grp78抗體可以顯著減少病毒的結合。c末端grp78抗體不會影響病毒結合(圖2)。

圖2 |抗grp78抗體抑制bhk-21細胞中的tmuv感染

3.?grp78在bhk-21細胞表面表達與和諧tmuv共定位

傳統(tǒng)上，grp78被認為是內(nèi)質網(wǎng)腔內(nèi)蛋白質。最近的研究表明，grp78也表達在細胞表面。grp78在bhk-21細胞表面的表達來自于分離bhk-21細胞膜蛋白和細胞蛋白，并分析蛋白質痕跡。western blot結果顯示grp78可在bhk-21細胞表面表達(圖3a）。然后觀察作者間接免疫熒光測定法grp78和tmuv在bhk-21細胞中的共定位。結果顯示grp78與bhk-21細胞表面tmuv共定位（圖3b）。

圖3 | grp78和tmuv在bhk-21共定位細胞表面

4.bhk-21細胞中grp78的rna干擾抑制tmuv感染

進一步證明grp78在tmuv通過結合和進入細胞的作用shrna降低grp78蛋白在bhk21細胞中的豐度。qrt-pcr表明在bhk-21細胞中grp78的mrna顯著抑制水平(圖4a）。純化細胞表面蛋白，分析蛋白質痕跡，顯示表面grp78蛋白質豐度降低約70%4b）。與空載體轉染的細胞相比，grp78 shrna其轉染細胞tmuv rna水平顯著降低(約60%)4c）。結果表明grp78在tmuv結合和進入bhk-21在細胞過程中起著重要作用。

圖4 |grp78 shrna感染48小時后對tmuv進入的影響

5.bhk-21在細胞中表達grp78會提高tmuv感染

然后作者發(fā)現(xiàn)了表達grp78在細胞中，它tmuv rna水平顯著提高(圖5)。通過敲低和表達功能實驗證明grp78蛋白支持tmuv進入bhk-21細胞。

圖5?|grp78表達48小時后對tmuv進入的影響

實驗結論

本文首次鑒定grp78是bhk-21細胞感染tmuv時的受體。grp78參與tmuv結合并進入受體bhk-21細胞在病毒感染中起著重要作用。grp78可以更好更好的了解tmuv發(fā)病機制。grp78對tmuv感染的多重關鍵作用可能為抗病毒藥物的設計提供新的目標和相關的目標tmuv其他預防和控制的信息。

tembusu病毒（tmuv）爆發(fā)和傳播給我國水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失。在本文的研究中，作者利用蛋白質組的學質譜鑒定技術來確定grp78蛋白是鴨tmuv感染的bhk-21細胞中的受體。這篇文章首先來自bhk-21細胞膜通過病毒覆蓋蛋白結合試驗（vopba）觀察到約70kda的tmuv結合蛋白質。免疫共沉淀結合lc-ms/ms鑒定grp78為與tmuv相互作用的蛋白質。grp78抗體可抑制tmuv與bhk-21細胞表面的組合。間接免疫熒光顯示grp78與tmuv在細胞表面共定位。此外，功能實驗表明降低/過表達grp78抑制/增加tmuv感染。這些結果表明grp78是參與tmuv新宿主因素。本文通過蛋白質組學質譜技術鑒定病毒與受體相結合的思路值得借鑒。上海鹿明生物科技有限公司協(xié)助完成蛋白質鑒定。

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